細胞冷凍保存的具體操作步驟

細胞冷凍保留的具體操作過程<o:p></o:p> 依據技術部給出的最新細胞冷凍保留辦法，現公布于下：<o:p></o:p> 1. 注意事項：<o:p></o:p> 1.1. 欲冷凍保留之細胞應在成長杰出(log phase) 且存活率高之狀況，約為80 – 90 %致密度。<o:p></o:p> 1.2. 冷凍前檢查細胞是不是仍保有其特有性質，例如hybridoma 應在冷凍保留前一至二日測驗是不是有抗體之發生。<o:p></o:p> 1.3. 留意冷凍保護劑之質量。DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌商品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保留，勿作多次凍結。Glycerol 亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保留。在敞開后一年內運用，因長時間貯存后對細胞會有毒性。 1.4. 冷凍保留之細胞濃度：<o:p></o:p> 1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在凍結24 小時后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細胞品種而異。Adenocarcinoma 凍結后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須最少5 x 106cells/ml。<o:p></o:p> 1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 % DMSO，如果不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保留之一起，亦應作一個backup culture，以避免冷凍失利。<o:p></o:p> 1.6. 冷凍辦法： 1.6.1. 傳統辦法: 4℃ 10 分鐘---> -20℃ 30 分鐘---> -80℃ 16 - 18 小時(或過夜) ---> 液氮槽vapor phase 長時間貯存。 1.6.2. 程序降溫：運用等速降溫機以–1 ～ -3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃，放在液氮槽vapor phase 長時間貯存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保留。<o:p></o:p> 細胞冷凍保留<o:p></o:p> 2. 資料： 2.1. 成長杰出之培育細胞 2.2. 新鮮培育基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無菌塑料冷凍保留管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計數盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II)<o:p></o:p> 3. 過程： 3.1. 冷凍前一日前替換半量或全量培育基，調查細胞成長景象。 3.2. 制造冷凍保留溶液(運用前制造)：將DMSO 參加新鮮培育基中，最終濃度為5-10%，混合均勻，置于室溫下待用。 3.3. 依細胞繼代培育之操作，搜集培育之細胞，取少數細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數細胞濃度及凍前存活率。<o:p></o:p> 3.4. 離心，去掉上清液，參加適量冷凍保留溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標明徹底之冷凍保留管中，1 ml/vial，并取少數細胞懸浮液作污染檢查。 3.5. 冷凍保留辦法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16～18 小時(或過夜) → 液氮槽vapor phase 長時間貯存。 3.6. 冷凍保留辦法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。<o:p></o:p> 十二月新品優惠中，期待來電咨詢訂貨！<o:p></o:p>

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